Анеуплоидиите са най-често срещаните хромозомни аномалии при хората и са основна причина за спонтанни аборти и вродени генетични заболявания. Нормалният човешки хромозомен набор (кариотип) е 46 ХХ или 46 ХY. Хромозомният набор при нормални телесни клетки се състои от двойки еднакви хромозоми (хомоложни хромозоми), тъй като в зиготата са се събрали бащиният и майчиният хромозомен набор, съответно от сперматозоида и яйцеклетката. Двойният хромозомен набор се нарича диплоиден (2n). В половите клетки хромозомният набор е единичен – хаплоиден (n).
В последните години има много информация относно произхода и етиологията на анеуплоидиите. Основната причина за възникване на анеуплоидии са грешки в Мейоза I, която протича в яйцеклетката по време на нейното узряване в майчиния организъм. Поради нарушения в клетъчното делене възникват нарушения в правилното разделяне на хромозомите (рекомбинация). Така в яйцеклетката може да попаднат две неразделени хомоложни хромозоми или да няма нито една. Поради това след като такава яйцеклетка бъде оплодена, в получената вече зигота ще се съберат три – тризомия, или ще остане само една хромозома (от бащиния хромозомен набор) – монозомия. Поради тази причина възрастта на майката е рисков фактор за повечето, ако не и всички тризомии при хората, и тези грешки в рекомбинацията са важен фактор за мейотичното неразделяне на хромозомите.
В последните години проучванията относно генетичните аномалии са насочени към три основни въпроса: Колко чести (и важни) са анеуплоидиите?; Коя е биологичната причина и какъв е митотичният/мейотичен източник на допълнителна или липсваща хромозома?; Кои са основните механизми, водещи до неразделяне на хромозомите, а от там и до анеуплоидия?
Отговорът на първия въпрос е: анеуплоидиите са удивително често срещано явление и са изключително важни за нашата клинична практика. Не по-малко от 5% от клинично доказаните бременности са тризомии или монозомии. Повечето от тях (основно монозомии) водят до прекъсване на бременността още в матката, което ги поставя на челно място в причините за спонтанни аборти, но някои от тях (главно тризомии) завършват с живо раждане на дете с вродени дефекти и умствено изоставане.
Тъй като главно тризомиите завършват с раждане на живо дете, за нас е важно да знаем причините, водещи до тези генетични аномалии. Най-често срещаните тризомии са 47 ХХY (Синдром на Клайнфелтер), 47 ХХХ (Тризомия Х) и Тризомия 21 (Синдром на Даун) – наличие на трета хромозома в 21-вата хомоложна двойка. На базата на редица анализи е установено, че независимо от това за коя хромозома се отнася, повечето тризомии настъпват още по време на овогенезата; много по-често грешките настъпват при първото мейотично делене, по време на овогенезата, и рядко при второто, което означава, че рискът нараства с увеличаване възрастта на жената. Относно гореспоменатите тризомии е известно, че при Тризомия 21 (Синдром на Даун) предоминират грешки в Мейоза 1, т.е. възрастта на майката е главна причина за възникването на тази аномалия; Тризомия 18 възниква най-често вследствие на грешки в Мейоза 2, т.е. след оплождането на яйцеклетката; Тризомия 47 ХХY може да има както майчин, така и бащин произход.
Хромозомни мутации при ембриони, получени от зиготи с абнормен брой пронуклеуси или абнормална морфология
Яйцеклетките обикновено показват признаци на оплождане 16-18 часа след инжектирането чрез ICSI. Това, което трябва да се види при оценяване на ембриона на този етап, са две добре отдиференцирани временни структури, наречени пронуклеуси (PN), централно разположени в яйцеклетката. Тези структури съдържат майчината и бащината ДНК, и за да се установи нормално оплождане там трябва да има точно два пронуклеуса /2PN/. Двата пронуклеуса трябва да са с еднаква големина, централно разположени и да имат няколко нуклеоли, които лесно могат да се видят под микроскоп.
Фиг.1 Нормално оплодена яйцеклетка – виждат се двата централно разположени пронуклеуса с нуклеолите в тях
Понякога, обаче, вместо два пронуклеуса, в зиготата може да се наблюдава само един (1PN) или повече от два пронуклеуса – 3PN, 4PN. Такива зиготи са генетично абнормални.
Фиг. 3 Абнормално оплодени яйцеклетки – 1PN и зигота с 4 или 5 пронуклеуса
Фиг. 2: Абнормално оплодени яйцеклетки – 1PN и зигота с 4 или 5 пронуклеуса
Зиготи с един пронуклеус (1PN)
Зиготи с един пронуклеус (1PN) може да се получат както при класическо IVF, така и при ICSI оплождане, с честота от 2% до 5%.
Изследването на кариотипа показва, че 46-80% от 1PN-ембрионите всъщност са диплоидини. Тези изследвания, обаче, не могат да отдиференцират дали диплоидията е получена вследствие на сливане на двата нормални пронуклеуса, партеногенетична активация на яйцеклетката или последваща диплоидизация, вследствие на асинхронно формиране на пронуклеусите. За да се разбере какъв е случая, трябва да се направи генетичен анализ на ембриона (най-често чрез FISH). Обобщените изследвания показват, че повечето диплоидини 1PN се получават при оплодени яйцеклетки. Има два механизма, по които това може да стане – главно поради асинхронно проявление на двата пронуклеуса, и в по-редки случаи – партеногенетично активиране само на яйцеклетката.
През 1995 година Levron доказва, че зигота с един пронуклеус при класическо ин витро оплождане се получава вследствие на сливане на мъжкия и женския пронуклеус. За да докаже това, Levron и екипът му отделят пронуклеуса (кариопласт) от останалата част на яйцеклетката (цитопласт) и ги анализират чрез FISH. Установват, че при диплоидините пронуклеуси 66% съдържат XY хромозоми, а останалите 33% – XX. Съответстващият цитопласт не съдържа ДНК, което показва, че асинхронно проявление на два пронуклеуса е рядко при такива зиготи, или изобщо не се случва.
Зиготи с един пронуклеус, получени вследствие на ICSI оплождане също са анализирани чрез FISH. Анализите показват, че такива яйцеклетки са активирани, имат възможност да се развиват, но не са оплодени. Такива ембриони не се връщат на ембриотрансфер.
Триплоидини (3PN) зиготи
Триплоидни зиготи могат да се получат вследствие на класическо IVF оплождане или ICSI процедура. При класическо IVF оплождане причината за получаване на 3PN е диспермия, т.е. едновременно оплождане на яйцеклетката от два сперматозоида (3PN-2PB) , докато при ICSI оплождане причината се дължи на яйцеклетката, която е генетично абнормална, т.е. носи диплоиден хромозомен набор (3PN-1PB). Кариотипните изследвания не различават, обаче, какъв е произхода на третия пронуклеус. Обикновено ембриолозите различаваме произхода на третия пронуклеус по наличието на едно или две полярни телца, но поради факта, че те често са фрагментирани, този метод не е сигурен.
Диспермия (3PN след IVF)
Най-често срещаната аномалия при класическо IVF оплождане на яйцеклетките, е диспермията. Такива ембриони се развиват, но ще останат в арест на стадия преди да се диференцират (т.е. ще спрат развитието си преди да достигнат до стадий бластоцист). Деленето при такива ембриони е неравномерно, обикновено тези ембриони се разделят директно на 3 или 4 клетки по време на първото клетъчно делене, много рядко някои се разделят на две. Изследванията показват, че повечето триплоидни ембриони са с мозаицизъм (генетична аномалия), много малко биват истински триплоиди. Staessen и Van Steiteghem установяват, че от ембриони с диспермичен произход очакваното съотношение ХХХ:ХХY:XYY е 25%:50%:25%. 3PN ембриони, които се делят директно на 3 клетки при първо делене (Ден 1) имат по-неравномерно разпределение на триплоидния генетичен материал, за разлика от ембрионите, които се делят на 2 клетки, след това на 4.
При човешките зиготи размерът на пронуклеусите варира, а останките от опашката на сперматозоида почти никога не могат да се идентифицират чрез наблюдение под светлинен микроскоп. За да се уверим за наличието на мъжки пронуклеус е необходимо да определим Х/Y съотношението, тъй като майчиния пронуклеус винаги съдържа Х хромозома, а бащиния може да съдържа както Х така и Y. Съотношението между Х и Y хромозомите при диспермични зиготи и дъщерните им бластомери трябва да е 1:3. Отстраняването на един от бащините пронуклеуси би довело до нормално Х:Y разпределение 1:1, но дори и след такава корекция, полученият ембрион ще бъде с мозаицизъм. Анализите на такива ембриони показват, че аномалията настъпва по време на сингамията. При нормални ембриони мозаицизмът настъпва след като ембрионът се е разделил на 2 клетки. Най-вероятно мозаицизмът настъпва в резултат на абнормално триполюсно делене при някои ембриони.
Фиг.4 Класическо IVF оплождане
3PN с майчин произход (3PN след ICSI)
Около 4% от яйцеклетките, инжектирани с един сперматозоид чрез ICSI имат 3 пронуклеуса и едно полярно телце. Такива яйцеклетки са генетично дефектни. Бластомери от съответни ембриони са анализирани чрез FISH и се доказва пълна триплоидия. Не се доказва наличието на ХYY хромозоми, а съотношението на ХХХ:ХХY е 1:1, което доказва, че причината за възникналата триплоидия е генетичен дефект на яйцеклетката. Също така, сигнификантно по-малко количество ембриони с мозаицизъм са изследвани при тези 3PN в сравнение с 3PN, получени в резултат от IVF. Това, както и факта, че много перфектни триплоиди са установени, показва, че хромозомите на трите пронуклеуса са се разпределили в единично биполярно делително вретено по време на сингамията, и предполага, че само една центрозома е активна при такива зиготи. При отстраняване на пронуклеуса, който е най-близо до първото полярно телце, тези зиготи се делят нормално и реално стават диплоидни.
Фиг. 5 Абнормално оплодена яйцеклетка – виждат се трите пронуклеуса, като също така се виждат дефектна зона пелуцида, вакуола и фрагментирани полярни телца
Апронуклеарни зиготи (0PN)
Около 1% от зиготите с две полярни телца не показват пронуклеуси. Чрез FISH анализ се установява, че 57% от тези ембриони са нормално диплоидини, 30% са полиплоидни или мозаични и 13% от тях са анеуплоидни. Трансфер на такива ембриони се препоръчва само ако няма нито един добре развиващ се ембрион с нормално видими два пронуклеуса. Понякогa пронуклеусите не се виждат поради силна гранулация на яйцеклетката или би могло да се пропуснат при оценяването поради несъответстващо време в проявяването. В такива случаи обикновено ебрионът се развива адекватно през последващите дни. Ако на Ден 2 такъв ембрион не се е разделил, това означава, че или генетично не е нормален, или яйцеклетката не се е активирала при инжектирането. Такива ембриони не се връщат на ембриотрансфер.
Фиг.6 Апронуклеарна зигота с множество рефрактилни телца
Разнородни пронуклеуси
Понякога при нормално оплодени яйцеклетки (2PN) образуваните пронуклеуси са с разнородни размери. Този дисморфизъм се наблюдава при около 14% от пациентите, и около 87% от изследваните зиготи с разнородни пронуклеуси показват дефекти, най-често мозаични. Трансфер на такива едмбриони не се препоръчва.
Фиг.7 Асиметрични (разнородни) пронуклеуси
