Диагностика на мъжки инфертилитет и селекция на сперматозоиди за асистирана репродукция с помощта на НВА тест
При прилагането на ICSI като метод за асистирана репродукция, се селектират единични сперматозоиди за инжектиране в яйцеклетката. Селекцията обикновено се извършва на базата на спермалната морфология. Оптималният вариант за селекция е използването на подвижни сперматозоиди с добра морфология, което гарантира тяхната жизненост и оплодителен потенциал. Смята се, че ако оплождането се извърши със сперматозоиди с добро качество, това ще доведе до образуването на по-добри и качествени ембриони и съответно до по-висока успеваемост от ин витро процедурите.
Развитието на репродуктивната медицина в последните години е насочено към търсенето на нови био маркери за подбор на качествени гамети и ембриони. С цел разшираването на възможностите за диагностика и лечение на мъжки стерилитет, и персонализиран подход към проблемите на всяка една двойка, МЦ КИРМ Плевен включва в диагностичния си панел НВА тестът, който е основан на способността на сперматозоидите да се свързват с хиалуронан.
Какво представлява Хиалуронанът (хиалуронова киселина – ХК)?
Хиалуронанът е захар, известна още като гликозаминогликан с високо молекулно тегло. Открива се на много места в организма и е основна съставка на междуклетъчните пространства. Интересен факт е, че хиалуронанът е ключов компонент от групата от клетки обвиващи яйцеклетката (кумулус оофорус). По време на финалните етапи от зреенето на сперматозоидите, те придобиват способността да се свързват с хиалуронана. Множество проучвания потвърждават факта, че способността за свързване на хиалуронан е важен индикатор за качеството и зрелостта на сперматозоидите. Установено е, че свързването на сперматозоидите за хиалуронана обвиващ яйцеклетката, е естествен механизъм на селекция на зрели сперматозоиди по време на естественото зачеване.
Маркери за качеството и зрелостта на сперматозоидите
Освен основните параметри, които се проследяват в стандартния семенен анализ (концентрация, подвижност, морфология и т.н.), съществуват и други маркери, които дават информация за качеството и зрелостта на сперматозоидите:
Наличие на цитоплазмени остътци – по време на финалните етапи от зреенето на сперматозоидите, се губи по-голямата част от излишната цитоплазма на герминативните клетки, предшественици на зрелите сперматозоиди. Нарушения в процеса на зреене, могат да доведат до задържане на цитоплазмени остатъци в близост до главата на сперматозоидите.
Спермална креатин фосфокиназа (КК) – Различни проучвания доказват, че повишените нива на ензима креатин фосфокиназа са свързани с дефекти във функцията на сперматозоидите и корелират с нисък процент на забременяване. Мъже с повишени стойности на на КК в семинална плазма имат понижен фертилитет. Това се обяснява с хипотезата, че когато на микроскопски препарат се наблюдава положително оцветяване за КК при сперматозоидите, това отразява наличието на задържана на излишна цитоплазма по време на спермиогенезата, т.е. сперматозоидите с цитоплазмени остатъци са с нарушена зрялост и оплодителна способност. В съвместно проучване две групи от университетите Йейл и Норфолк, САЩ, установяват, че 15% от 84 изследвани двойки с нормозооспермия, са с повишено съдържание на КК и липса на бременност.
Huszar, G., Vigue, L. and Morshedi, M. (1992) Sperm creatine phosphokinase M-isoform ratios and fertilizing potential of men: A blinded study of 84 couples treated with in vitro fertilization. Fertility and Sterility, 57: 882-888.
Спермиогенеза: Зрял сперматозоид и сперматозоид с арест в развитието
HspA2 шаперонов протеин – HspA2 е шаперонов протеи, част от синаптонемалния комплекс, подпомага протичането на мейозата и транспортира вътреклетъчни компоненти, като ензими участващи в поправката на ДНК. Експресията му на повърхността на сперматозоидите е свързана с естествените процеси на ремоделиране на плазмената мембрана на сперматозоида и експресирането на повърхността, на свързващи със яйцеклетката места. Този протеин се открива във високи нива при нормални сперматозоиди. При сперматозоиди с ниски нива на HspA2, е по-вероятно да се наблюдават хромозомни аномалии и повишена ДНК фрагментация, както и липса на оплождане.
Свързване на хиалуронан
Свързването на сперматозоидите към хиалуронова киселина (ХК), е индикатор за способнастта им да доведат до развитието на нормална и успешна бременност. Зрели, хиалуроноан свързващи сперматозоди са основно без цитоплазмени остатъци. Това е от особена важност, тъй като цитоплазмените остатъци се различават трудно при селекцията на сперматозоиди за ICSI при ин витро оплождане.
При селекция на сперматозоиди за ин витро оплождане, чрез свързване на хиалуронан, редица проучвания установяват:
• Намаляване 4-6 пъти честотата на хромозомните аномалии при плода;
• Повече от 99% от ХК-свързаните сперматозоиди се характеризират с висок ДНК интегритет в сравнение с 55% с такъв при не селектираните сперматозоиди;
• Селектират се сперматозоиди с ниски нива на КК;
• Селектираните сперматозоиди се характеризират с високи нива на HspA2.
Броителна камера с хиалуронан за НВА тест.
Въз основа на факта, че зрелите сперматозоиди се свързват с хиалуронова киселина, е разработен НВА тест, като възможност за диагностика в андрологична лаборатория, така и за селекция на сперматозоиди за ин витро оплождане. Свързването на сперматозоидите настъпва след около 8-10 мин. Отчитането на ХК свързването е базирано пропорцията свързани сперматозоиди с енергично трептящи опашки, спрямо подвижните несвързани сперматозоиди. Неподвижните сперматозоиди, с неподвижни опашки не се вземат предвид.
Характеристики на свързаните с ХК сперматозоди:
• Жизнени сперматозоиди;
• Без цитоплазмени остатъци;
• Нормална морфология по Крюгер;
• Нормално пакетиране на хроматина;
• Добър интегритет на ДНК, без фрагментации;
• Отсъствие на апоптоза;
• Нормална честота на хромозомните анеуплоидии.
Приети са три степени на свързване – свързване ≥80% (отлично свързване) при тази група пациенти е установено, че КК активността е в нормални граници, не е налице мъжки фактор за инфертилитета, така че не се налага прилагане на някаква терапия. Свързване между 60 и 80% (интермедиерно свързване) при тази група от пациенти е установена повишена активност на КК и в такъв случай двойката би могла да бъде насочена към интраутеринна инсеминация като избор на метод за асистирана репродукция . Свързване ≤60% (намалено свързване). При тази група пациенти КК активност може десетократно да надвишава нормата, което е показателно за наличие на голям брой сперматозоиди с цитоплазмени остатъци – индикатор за проблем в етапите на зреене на сперматозоидите. При наличието на такъв резултат, изследването следва да се повтори с цел потвърждаване на резулата и в такъв случай е удачно пациентите да бъдат насочени за лечение с ICSI процедура, след НА селекция на сперматозоидите.
Резултата от НВА теста е показателен за успеха на бременността
Проучване направено сред двойки опитващи да забременеят чрез вътрематочна инсеминация и ин витро оплождане (IVF или ICSI), установява, че при увеличаване с 1% на резултата от НВА, се наблудава увеличение с 4% на възможността за забременяване. Скорошно глямо мултицентрово проучване (2011) направено сред пациенти участващи в ин витро процедури установява, че при двойките, в които мъжете имат висок процент зрели сперматозоиди в еякулата, установено чрез способността им да се свързват с хиалуронова киселина, ембрионите получени в следствие инвитро оплождането са с по-добра морфология, с по-нисък процент фрагментация, в сравнение с ембрионите на двойки, при които сперматозоидите на партньора са с по-нисък процент зрели сперматозоиди. При пациентите от първата група по-голяма част от ембрионите достигат до стадий бластоцист, процента на клиничните бременности е по-висок, а процента на спонтанните аборти по-нисък в сравнение с пациентите от групата по-нисък процент свързване на НА т.е. по-висок процент незрели сперматозоиди с цитоплазмени, ядрени или морфологични дефекти.
