Известно е, че яйцеклетката е най-голямата клетка в човешкия организъм, а в криобиологията размерът или по-скоро масата е решаващ фактор. Доста противоречив факт е, че натрупаната маса от клетки експоненциално намалява по време на първата седмица от ембрионалното развитие и на стадий бластоцист е най-ниска: от около 1/10 – 1/100 от масата на яйцеклетката. Този процес се случва заедно с намаляване и съдържанието на вода.
Въпреки че разтворът, натрупан в бластоцьола (при бластоцистите това е кухината, изпълнена с течност) може да бъде потенциален източник на увреждане или чрез образуване на ледени кристали, или чрез натрупване и бавно разреждане на токсични криопротектанти, тези механизми причиняват повече вреди, когато се появят вътреклетъчно в яйцеклетката.
Отделно от размера, формата на яйцеклетката също е проблемна при витрификация. Почти перфектната сфера забавя развномерното разпределение на всички субстанции, включително пермеабилните криопротектанти, идващи отвън или освободени от яйцеклетката. От тази гледна точка промените във формата от осмотичния ефект по време на еквилибрирането може да са от полза, но могат да доведат и до увреждане на цитоскелета.
Третият основен фактор е възможно най-малкият брой клетки, поради което яйцеклетката прилича на комарджия, играещ „ва банк” (всичко или нищо). Многоклетъчните ембриони могат да оцелеят дори при 50% загуба на техните клетки, докато яйцеклетката има само един шанс и няма „план Б” за регенериране от сериозно увреждане. Когато замразяваме яйцеклетки трябва да изберем възможно най-внимателно подхода, за да излезем победители и те да оцелеят след процедурата по замразяване и размразяване.
За съжаление освен факторите, изброени по-горе има и други фактори, които допринасят за чувствителността на яйцекетките по време на замразяване и възможните криоувреждания.
Увреждания от охлаждането (chilling injuries) – това се случва при относително високи температури и предизвиква необратимо увреждане на цитоплазмените липиди, богатите на липиди клетъчни мембрани и микротубулите. От друга страна мембраните са изключително чувствителни и бързо преминават от течно в гелообразно състояние, необратим процес, който е вреден за по нататъшното развитие. По неизвестни причини, ако яйцеклетката вече е оплодена, тогава мембраната на зиготата не е толкова чувствителна на такъв тип увреждане.
Осмотичният шок при еквилибрирането може да доведе до свиване и промяна във формата на яйцеклетката, както и до възможно увреждане на цитоскелета. От друга страна осмотичният шок, който може да се случи по време на разреждането (dilution) може да доведе до раздуване, разкъсване на мембраната, лизиране и до моментална смърт на яйцеклетките.
Уврежданията са общ резултат от всички процедури по криоконсервация и се срещат по-често при яйцеклетки, отколкото при ембриони. Докато последиците от увреждане на зона пелуцида са подобни и при двете, ембрионите все пак могат да оцелеят дори да има увреждане на мембраната им, докато за яйцеклетката такова увреждане би било фатално. Най-важното е използваният метод да сведе до минимум уврежданията от охлаждането (chilling injuries).
Методите за витрификация – Cryotop и Cryoloop използват смесица от сравнително ниски концентрации на DMSO и етиленгликол, което не предизвиква сериозни аномалии в структурата на делителното вретено и могат да се гарантират срванително високи проценти на развитие. Проблемът с втвърдяването на зона пелуцида и след това ниският процент на оплождане са преодолени с откриването на ICSI като метод за оплождане.
Фиг. 1 Среди за замразяване и размразяване на яйцеклетки и ембриони
Криотоп (Cryotop) техниката: Използва се за криоконсервация на зрели яйцеклетки на стадий МII. Криопротектантите са етилен гликол, DMSO и сукроза (смесица от пермеабилни и непермеабилни). Яйцеклетките при този метод се замразяват от 2-6 часа след фоликулната пункция.
След всички стъпки на еквилибриране и витрифициране цялата излишна среда се премахва като върху яйцеклетките се оставя само тънък филм от витрификационна среда.
Критопът се слага в течния азот с бързо и непрекъснато вертикално движение, за да се гарантира максимална скорост на охлаждане (23 000 ° C/ мин). Накрая под течния азот се поставя капачката на криотопа, за да се осигури защита от механични увреждания по време на прехвърлянето в дюаровия съд, както и по време на самото съхранение.
Криотоп техниката се използва в голям брой лаборатории в цял свят за витрификация на яйцеклетки. Всички тези лаборатории (включително и нашата) показват по-голям процент на оцеляване, оплождане, развитие и в крайна сметка повече бременности, постигнати с този метод, отколкото с традиционното замразяване (slow freezing).
Фиг. 2 Ембрионите вече са прибрани в дюаровия съд
Още по темата: Криоконсервацията вече е част от стандартните методи в медицината
