Дефекти при яйцеклетките и влиянието им върху крайния резултат от ин витро процедурата, или „Защо не от всяка яйцеклетка се получава бебе?”

Технологията на ин витро оплождането се състои в оплождане на зрели яйцеклетки (стадий Метафаза II), получаване на ембриони и връщането им в маточната кухина на реципиентките, за да се имплантират и да доведат до бременност. Качеството на яйцеклетките пряко влияе върху оплождането и компетентността на ембрионите за по-нататъшното им развитие. Критериите, показващи качеството на яйцеклетките се делят на: морфологични, клетъчни и молекулярни. Морфологичните критерии за качество на яйцеклетките се използват преди тяхното оплождане ин витро, защото качеството на яйцеклетките има най-голямо влияние върху резултатите от оплождането с ICSI, ранното развитие и имплантирането на ембрионите. Поради това, качеството на яйцеклетките е определящ фактор при оплождането им, култивирането на ембриони с високо качество и лечението на инфертилитета.

Любопитното е, че при двата метода на оплождане, използвани в една ембриологична лаборатория, качеството на яйцклетките се определя по различен начин. При конвенционалното (класическото) ин витро оплождане (IVF) морфологичната оценка на извадените след фоликулната пункция яйцеклетки се извършва на стереомикроскоп въз основа на вида на кумулусните клетки, заобграждащи всяка една яйцеклетка.

Снимка 1: Кумулусно-овоцитен комплекс

В случаите на ICSI оплождане обаче качеството на всяка една яйцеклетка се определя на инвертен микроскоп на голямо увеличение и то след като яйцеклетката е била оголена (с помощта на ензима хиалуронидаза са премахнати всички заобграждащи кумулусни клетки и клетките на корона радиата) и така се оценяват цитоплазмата и нейните включения, перивителинното пространство и самата зона пелуцида. Това оценяване осигурява информация за стадия на развитие на яйцеклетката [герминален везиукл (GV) на профаза I , метафаза I (MI) или метафаза II (MII)] и качеството [признаци за дегенерация на цитоплазмата, полярното телце (PB) или зона пелуцида ].

Снимка 2- GV на профаза I

След това всички яйцеклетки на MII се подлагат на ICSI оплождане и потенциалът за развитие на получените ембриони се прогнозира изключително на базата на собствената им вече мофология, независимо от определеното преди това качество на яйцеклетките, от които са получени. Крайният резултат от ICSI оплождането зависи от качеството на извадените яйцеклетки.

Снимка 3 – GV на профаза I

Нормално оплождане и ранно развитие на ембрионите се наблюдава дори и при яйцеклетките с дефекти и абнормна морфология на цитоплазмата, но получените ембриони нямат същия потенциал за имплантация, като тези, получени от яйцеклетки с нормална цитоплазма.

Снимка 4: Оплодена яйцеклетка с лоша морфология

Снимка 4: Оплодена яйцеклетка с лоша морфология

След премахване на кумулусните клетки и тези на корона радиата, основните абнормалности в морфологията, които се наблюдават са изключително висока гранулираност, цитоплазмени включения като вакуоли, клъстери от гладък ендоплазмен ретикулум, рефрактилни и некротични телца.

Нормалните яйцеклетки имат чиста цитоплазма с еднородна текстура и хомогенна финна гранулираност.

Табл. 1 Критерии, показващи качеството на яйцеклетките

Мейотично зреене на яйцеклетката

Зреенето на яйцеклетките включва два, свързани помежду си процеса: ядрено и цитоплазмено зреене.

При стимулация яйцеклетките реинициират (започват отново) мейоза. Ядрото на яйцеклетката променя структурата си. Ядрената мембрана на яйцеклетката изчезва. Микротубулите се организират в биполярно вретено и всички хромозоми се подреждат на екватора на клетката. Първото мейотично делене продължава в яйцеклетката; след това делене първото полярно телце се отделя и навлиза в перивителинното пространство. След това започва второто мейотично делене, което спира в Метафаза II. Този процес е известен като ядрено зреене на яйцеклетката.

За да може успешно да се оплоди яйцеклетката след ICSI и да се стигне до развитието на нов организъм, ядрото и цитоплазмата на яйцеклетката трябва да са зрели по едно и също време. Ако цитоплазмата на яйцеклетката е незряла, ембрионът не би могъл да се развива нормално след оплождането. Зрелостта на цитоплазмата на яйцеклетката се доказава, когато 16-18 часа след ICSI наблюдаваме оплождане, а след това и развитие на ембриона при ин витро условия.

Кумулусно-овоцитни комплекси (COCs): Наблюдава се и се оценява експандирането (разпъването) и на кумулуса и на короната поотделно. Кумулусно-овоцитните комплекси се класифицират според компактността на кумулуса и характеристиките на цитоплазмата на яйцеклетките. Броят на слоевете кумулусни клетки е определящ фактор за качеството на яйцеклетките. Качеството на яйцеклетките е по-добро, когато яйцеклетките са заобградени от повече слоеве клетки.

Снимка 5, 6: Кумулусно-овоцитни комплекси

Снимка 5: Кумулусно-овоцитни комплекси

Снимка 6: Кумулусно-овоцитни комплекси

Цитоплазма и полярно телце: Преди ICSI, след определяне качеството на кумулусно-овоцитните комплекси, самите кумулусни клетки се отстраняват с помощта на ензима хиалуронидаза. Така се осигуряват много възможности за по-добро (точно) оценяване структурата на яйцеклетката. Цитоплазмата на човешките яйцеклетки се калсифицира според оцветяването и, гранулираността (големи или малки гранули; хомогенно или клъстерно разпределение на гранулите; в центъра или в периферията на яйцеклетката), размера на перивителинното пространство и разпределението на органелите (вакуоли, ендоплазмен реикулум).

Снимки 7, 8, 9, 10: Яйцеклетки с централно гранулирана цитоплазма

Снимки 7: Яйцеклетки с централно гранулирана цитоплазма

Снимки 8: Яйцеклетки с централно гранулирана цитоплазма

Снимки 10: Яйцеклетки с централно гранулирана цитоплазма

Снимки 9: Яйцеклетки с централно гранулирана цитоплазма

Снимки 11, 12: Яйцеклетки с рефрактилни телца

Снимки 11: Яйцеклетки с рефрактилни телца

Снимки 12: Яйцеклетки с рефрактилни телца

Снимки 13, 14, 15: Яйцеклетки с некротични телца

Снимки 13: Яйцеклетки с некротични телца

Снимки 14: Яйцеклетки с некротични телца

Снимки 15: Яйцеклетки с некротични телца

Снимка 16, 17, 18, 19: Яйцеклтки с вакуоли/ клъстери от ЕПР

Снимка 16: Яйцеклтки с вакуоли/ клъстери от ЕПР

Снимка 17: Яйцеклтки с вакуоли/ клъстери от ЕПР

Снимка 18: Яйцеклтки с вакуоли/ клъстери от ЕПР

Снимка 19: Яйцеклтки с вакуоли/ клъстери от ЕПР

Снимка 20, 21: Вакуолизирани яйцеклетки след интрацитоплазмено инжектиране на един сперматозоид (ICSI)

Снимка 20: Вакуолизирани яйцеклетки след интрацитоплазмено инжектиране на един сперматозоид (ICSI)

Снимка 21: Вакуолизирани яйцеклетки след интрацитоплазмено инжектиране на един сперматозоид (ICSI)

Според тези морфологични критерии, човешките яйцеклетки се класифицират като: 1) нормални яйцеклетки, 2) яйцеклетки с външноцитоплазмени аномалии (тъмна зона пелуцида и голямо перивителинно пространство), 3) яйцеклетки с вътрецитоплазмени аномалии (тъмна или гранулирана цитоплазма и цитоплазмени фрагменти), 4) аномалии във формата на яйцеклетките, и 5) яйцеклетки с много на брой аномалии (комбинация от различни морфологични дефекти).

Снимки 22, 23: Яйцеклетки с голямо перивителинно пространство

Снимки 22: Яйцеклетки с голямо перивителинно пространство

Снимки 23: Яйцеклетки с голямо перивителинно пространство

Снимка 24: Яйцеклетка с тъмна и деформирана зона пелуцида

Cнимки 25, 26: Яйцеклетки с деформирана форма на зоната и рефрактилни телца

Cнимки 25: Яйцеклетки с деформирана форма на зоната и рефрактилни телца

Cнимки 26: Яйцеклетки с деформирана форма на зоната и рефрактилни телца

Снимки 27, 28, 29, 30, 31, 32: Яйцеклетки с комбинация от морфологични дефекти (голямо перивителинно пространство, изтънена зона пелуцида, вакуоли, некротични телца, фрагментирани полярни телца, централно сртупване на гранули в цитоплазмата)

Снимки 27: Яйцеклетки с комбинация от морфологични дефекти (голямо перивителинно пространство, изтънена зона пелуцида, вакуоли, некротични телца, фрагментирани полярни телца, централно сртупване на гранули в цитоплазмата)

Снимки 28: Яйцеклетки с комбинация от морфологични дефекти (голямо перивителинно пространство, изтънена зона пелуцида, вакуоли, некротични телца, фрагментирани полярни телца, централно сртупване на гранули в цитоплазмата)

Снимки 29: Яйцеклетки с комбинация от морфологични дефекти (голямо перивителинно пространство, изтънена зона пелуцида, вакуоли, некротични телца, фрагментирани полярни телца, централно сртупване на гранули в цитоплазмата)

Снимки 30: Яйцеклетки с комбинация от морфологични дефекти (голямо перивителинно пространство, изтънена зона пелуцида, вакуоли, некротични телца, фрагментирани полярни телца, централно сртупване на гранули в цитоплазмата)

Снимки 31: Яйцеклетки с комбинация от морфологични дефекти (голямо перивителинно пространство, изтънена зона пелуцида, вакуоли, некротични телца, фрагментирани полярни телца, централно сртупване на гранули в цитоплазмата)

Снимки 32: Яйцеклетки с комбинация от морфологични дефекти (голямо перивителинно пространство, изтънена зона пелуцида, вакуоли, некротични телца, фрагментирани полярни телца, централно сртупване на гранули в цитоплазмата)

Снимка 33: Яйцеклетка с деформирана форма, вакуоли игранули в перивителинното пространство

Снимка 33: Яйцеклетка с деформирана форма, вакуоли игранули в перивителинното пространство

Морфологията на първото полярно телце индикира (показва) постовулаторната възраст на човешката яйцеклетка. Дегенерирането на първото полярно телце показва яйцеклетка в напреднала възраст. Някои морфологични критерии на първото полярно телце като форма (кръгла или овална), размер (голям или малък), повърхност (гладка или ръбеста), и интегритета на цитоплазмата (интактна или фрагментирана) се използват също за оценка на качеството на яйцеклетката. Яйцеклетките с фрагментирано полярно телце се развиват по-зле след оплождане, отколкото тези с нормално полярно телце.

Яйцеклетките с огромни полярни телца в повечето случаи не са нормални генетично и след инжектиране показват признаци на атипично оплождане (наличие на повече от 2 пронуклеуса в цитоплазмата).

Снимка 34: Яйцеклетка с гигантско полярно телце, която показва признаци на атипично оплождане (3PN)

Снимка 34: Яйцеклетка с гигантско полярно телце, която показва признаци на атипично оплождане (3PN)

Перивителинно пространство и зона пелуцида: Перивителинното пространство (PVS) на човешките яйцеклетки може да варира по размер (уголемено или не) и по съдържание (присъствието и отсъствието на зрънца). Доказано е, че яйцеклетките с големи перивителинни пространства се развиват по- зле след ICSI от тези с нормално перивителинно пространство. Яйцеклетките, които имат много големи зрънца в перивителинното пространство също се развиват по-зле след оплождане, отколкото тези без такива зрънца.

Снимка 35: Яйцеклетка със счупена зона пелуцида – вижда се яйцеклетката, която вече е извън зоната (FZ – fragile zona)

Снимка 35: Яйцеклетка със счупена зона пелуцида – вижда се яйцеклетката, която вече е извън зоната (FZ – fragile zona)

Дебелината на зона пелуцида варира от 10 до 31 µm и това не е свързано с диаметъра на цитоплазмата. Дебелината на зона пелуцида повлиява на проникването на сперматозоида в яйцеклетката. Особено важно е това при класическо ин витро оплождане, където е необходимо дебелината на зона пелуцида да е по-малка от около 19-20 µm. Задебелената зона (22 µm и повече) е индикация за използване на ICSI оплождане след предшестващи неуспешни ин витро опити с класическо ин витро оплождане. Дебелината на зона пелуцида не повлиява развитието на ембриона след ICSI.

Гигантски яйцеклетки – Гигантските яйцеклетки са с около 30% по-големи в диаметър от нормалните яйцеклетки. Те се срещат при жени от всички възрастови групи – от 22 до 44 и повече години с честота около 0,3%, като с възрастта процентът нараства и може да достигне до 1%. Ако такава яйцеклетка се оплоди, в повечето случаи се получава триплоиден ембрион. Тъй като те са източник на триплоидност, дължаща се на диплоидност на яйцеклтката и за да се избегнат нежелани аборти, такива яйцеклетки не се инжектират по време на ин витро процедура. Ембриони, получени от гигантски яйцеклетки покават бройни хромозомни аберации и е доказано наличието на триплоидни/тетраплоидни ядра, както и различни видове мозаицизъм и затова такива ембриони не се трансферират при ин витро.

Снимка 36: Гигантска яйцеклетка 

Снимка 36: Гигантска яйцеклетка

В заключение може да се каже, че преди всяка една процедура по оплождане на яйцеклетките, качеството им трябва да се определи добре, защото това има огромно влияние върху развитието на ембрионите след това. Най-прецизно се определя качеството като се използва комплексно наблюдение на характеристиките по едно и също време на структурата на кумулусния комплекс, цитоплазмата на яйцеклетката, полярното телце, перивителинното пространство и зона пелуцида.

[quote font=“verdana“ font_size=“16″ bgcolor=“#“ color=“#333″ bcolor=“#dd3333″ arrow=“yes“]Защо се замразяват човешки яйцеклетки?[/quote]